液相色譜柱后衍生化法用于氨基甲酸酯類農(nóng)藥的測(cè)定

    提要研究了用液相色譜(HPLC)柱后衍生化熒光檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定氨基甲酸酯類農(nóng)藥的方法。用RadialPakC18柱在不同流動(dòng)相梯度條件下對(duì)六種農(nóng)藥和三種代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離，通過(guò)柱后衍生化技術(shù)提高熒光檢測(cè)器的靈敏度。結(jié)果表明：該方法分離效果良好，低檢測(cè)濃度為2mg/l，小檢出量為2ng。

　　1、前言

　　氨基甲酸酯農(nóng)藥種類多，用量大，需建立一種選擇性強(qiáng)而又靈敏、簡(jiǎn)便的多殘留測(cè)定方法。常規(guī)的氣相及液相色譜測(cè)定法分別具有前處理繁瑣費(fèi)時(shí)和檢測(cè)靈敏度不高等問(wèn)題，均難以適應(yīng)對(duì)環(huán)境中微量殘留農(nóng)藥快速分析的要求。本文研究的是應(yīng)用HPLC柱后衍生化熒光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定的方法。該方法國(guó)外已有一些研究，而國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。

　　本方法的建立是基于氨基甲酸酯類農(nóng)藥在結(jié)構(gòu)上均帶有甲胺基團(tuán)(-NHCH3)，在堿液作用下都可水解產(chǎn)生甲胺這一特性。在HPLC的色譜柱與檢測(cè)器間加一柱后反應(yīng)裝置，農(nóng)藥及其代謝物先經(jīng)徑向加壓柱分離，再在裝置內(nèi)堿解產(chǎn)生甲胺，甲胺與衍生化試劑反應(yīng)可生成一種強(qiáng)熒光物質(zhì)1-(2-羥乙基)硫基-2-甲基異吲哚，用高靈敏的熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)即可。其反應(yīng)式如下面所示。

　　2、實(shí)驗(yàn)部分

　　2.1 儀器與試劑

　　儀器：德世AGR1100液相色譜儀+熒光檢測(cè)器， 自動(dòng)梯度控制器，1100高壓恒流泵，S3100進(jìn)樣器，色譜工作站以及溫度控制器、柱后反應(yīng)裝置、Z型徑向加壓器，柱為RadialPakmBondaPakC18徑向加壓柱。

　　試劑氧氫化鈉，優(yōu)級(jí)純；四硼酸鈉、鄰苯二甲醛(OPTA)，分析純；巰基乙醇(MERC)，化學(xué)純；甲醇，分析純，重蒸過(guò)濾；超純水，過(guò)濾備用。

　　農(nóng)藥標(biāo)樣涕滅威，涕滅威砜，涕滅威亞砜，呋喃丹，3-OH呋喃丹，西維因，速滅威，葉蟬散，巴沙等。

　　2.2 試驗(yàn)方法

　　2.2.1 試液配制

　　OPTA-MERC稱19.1g四硼酸鈉溶于約800ml超純水中，另稱0.1g鄰苯二甲醛溶于10ml甲醇中。緩慢將鄰苯二甲醛溶液滴加到硼砂溶液中，邊加邊搖動(dòng)。在通風(fēng)櫥內(nèi)加50mL巰基乙醇于混合液中，搖勻后用超純水稀釋到1000ml，使四硼酸鈉溶液濃度為0.05mol/L。用0.45mm濾膜過(guò)濾，冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

　　NaOH溶液稱2.0gNaOH溶于1000ml超純水中，使其濃度為0.05mol/L。用0.45mm濾膜過(guò)濾備用。農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)確稱取0.01g各種農(nóng)藥純品分別置于100ml容量瓶中，其中涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、呋喃丹、3-OH呋喃丹和速滅威用超純水溶解定容，西維因、葉蟬散、巴沙用甲醇定容，使各農(nóng)藥溶液的濃度為100mg/L。再分別用超純水稀釋成一定濃度直接進(jìn)樣測(cè)定(環(huán)境水樣用0.45mm濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣測(cè)定。該濾膜具有濾速快、不易吸附的特點(diǎn)，樣品過(guò)濾后濃度不變)。

　　2.2.2 分析條件

　　流動(dòng)相：甲醇-水，流速1ml/min；OPTA-MERC、NaOH泵流速均為0.5ml/min；熒光檢測(cè)器Excitation338nm，Emission455NM，靈敏度1/64；柱后反應(yīng)溫度95±0.2℃；記錄儀紙速0.5cm/min；用外標(biāo)法定量，進(jìn)樣量1ml。

　　3、結(jié)果和討論

　　3.1 農(nóng)藥的分離及反應(yīng)條件的選擇

　　按照上述儀器條件，對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了選擇。用甲醇/水固定比例的流動(dòng)相進(jìn)行分離時(shí)，六種農(nóng)藥和三種代謝物在RadialPakiC18柱上得不到很好的分離，而用甲醇-水以一定程序進(jìn)行梯度洗脫后得到了較好的分離效果。在此基礎(chǔ)上若將其中的甲醇改為甲醇：乙腈=80：20(V/V)的混合液后再與水進(jìn)行梯度淋洗，則分離效果更好，涕滅威的兩個(gè)代謝產(chǎn)物可得到*分離。

　　本試驗(yàn)中衍生化試劑OPTA-METC及NaOH的濃度對(duì)檢測(cè)也有較大影響。適宜的濃度：OPTA為0.1-0.2g/L，MERC為50mL/L，NaOH為0.05mol/L。濃度過(guò)高不僅不能增加靈敏度，反而會(huì)使背景噪音加大而干擾測(cè)定。試劑配制后的使用期均不宜超過(guò)一周。

　　3.2 方法的靈敏度與線性關(guān)系

　　在上述試驗(yàn)條件下，本方法的低檢出濃度為2mg/L，低檢出量為2ng。圖3為進(jìn)樣量1ml時(shí)農(nóng)藥的低檢測(cè)圖譜。

　　將供試農(nóng)藥標(biāo)液分別用超純水稀釋成2、4、6、8、10、12mg/L的溶液，測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系均良好。

　　3.3 土壤中氨基甲酸酯農(nóng)藥的測(cè)定

　　分別稱取風(fēng)干、過(guò)20目篩的土樣10g，添加一定濃度的農(nóng)藥標(biāo)液，加10ml超純水振蕩提取，離心，取上清液用0.45mm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣測(cè)定。每種濃度做三組平行試驗(yàn)，結(jié)果涕滅威、涕滅威砜和呋喃丹同樣得到很好的分離。回收率為84.0-96.2%。

　　4、結(jié)論

　　以上試驗(yàn)表明，用HPLC柱后衍生化法測(cè)定多殘留的氨基甲酸酯農(nóng)藥具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏的特點(diǎn)，尤其適用于地下水和地表水中微量農(nóng)藥的檢測(cè)。由于該方法的進(jìn)樣量較大，易造成色譜柱污染堵塞，因此在實(shí)際檢測(cè)時(shí)在柱前加一預(yù)保護(hù)柱以延長(zhǎng)柱的使用壽命。